Vector biotin, (strept)avidin rendszerek

Korábbi módszerek

Mielőtt a Vector a biotin-avidin rendszert (amely már streptavidinnel is elérhető) bevezette volna, a kutatók közvetlenül enzimmel jelölt primer és szekunder antitesteket használtak szöveti, blot és mikrotiter lemez detektálásra (1., 2. ábra). Ezt a direkt/indirekt módszert a PAP módszer (3. ábra) követte, amely már nyújtott valamennyi jelerősítést.

A biotin-avidin rendszer

A biotin-avidin rendszer bevezetésével meglehetős jelerősítést lehetett elérni a korábbi módszerekehez képest. Az avidin egy tojásfehérjéből kinyert glikoprotein, amely kiemelkedően magas affinitással rendelkezik a biotin felé (affinitási konstans > 10¹⁵M^-1). A streptavidin hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, mint az avidin, csak kisebb az affinitása a biotinhoz. Sok biotin molekula kapcsolható egy fehérjéhez, ami lehetővé teszi, hogy egy fehérje molekula több avidin molekulát is kössön. Ha a biotinilálást enyhe körülmények között hajtjuk végre a fehérje biológiai aktivitása megmarad. Az avidinhez különböző ligandokat kovalensen kötve, mint pl. fluorokrómok, enzimek vagy EM markerek, ezt a rendszert nevezzük biotin-avidin rendszernek, sokféle biológiai struktúra és folyamat tanulmányozása lehetséges. A biotin-avidin rendszer különösen hasznosnak bizonyult az antigének, glikokonjugátumok és nukleinsavak kimutatásában, ahol is biotinilált antitesteket, (biotinilált) lektineket és (biotinilált) nukleinsav próbákat használnak.

Különböző biotin-avidin módszerek

Az évek során számos alap biotin-avidin technika fejlődött ki. Az egyik legkorábban kifejlesztett, de jelenleg legkevésbé használt technika, amelyet "szendvics", vagy "híd" technikának neveznek azon alapul, hogy egy avidin több biotinkötő hellyel rendelkezik. A biotinilált antitest hozzáadása után avidint adnak a reakcióhoz, majd ezután a biotinilált enzimet vagy EM markert.

A következő technika a "kovalens konjugátum", vagy "jelölt avidin" ("jelölt streptavidin") néven vált ismertté (4. ábra). A biotinilált primer vagy szekunder antitest hozzáadása után kovalensen konjugált (strept)avidin és enzim/fluorokróm/EM marker kerül a rendszerbe.

Egy példa erre a szöveti metszet festése egy antigén determinánsra specifikus monoklonális antitesttel. A primer antitest alkalmazása után biotinilált anti-egér IgG-t adnak a rendszerhez, amelyet peroxidáz konjugált avidin követ.

Az előhívás a peroxidáznak megfelelő szubsztrát hozzáadásával történik.

A legutóbbi és legszéleskörűbben használt technika a Vector által szabadalmaztatott "ABC vagy "előre kialakított komplex" módszer (5., 6. ábra). A biotinilált másodlagos vagy elődleges antitest alkalmazása után egy avidin/streptavidin és biotinilált enzimmel előre kialakított komplex hozzáadása tröténik. Ez utóbbi technika tűnik a legérzékenyebbnek a legtöbb alkalmazásban.

Bár minden technikának megvan a maga előnye, manapság széles körben elismert, hogy a biotin-avidin rendszer biztosítja a legnagyobb érzékenységet a fluoreszcens és enzim alapú detektálásban. A módszer rugalmassága lehetővé teszi többféle marker bevezetését/cseréjét és olyan antigének detektálását, amelyet más módszerrel nehezen vagy egyáltalán nem lehet kimutatni.

A biotin-avidin rendszer előnyei

A biotin-avidin rendszernek számos előnye van a direkt marker kötéssel szemben (antitesthez, lektinhez vagy nukleinsav próbához):

• A biotin-avidin rendszer növelheti az érzékenységet a többszörös kötőhely megléte miatt.
• Az avidint nagy fluorokróm/fehérje aránnyal lehet előállítani és az avidin konjugátumok nagyon stabilak.
• Csak egyféle jelölt konjugátum (avidin vagy streptavidin) kell, mivel az különböző biotinilált lektinnel, antitesttel és próbával használható.
• A biotin-avidin rendszer esetén csökkenthető a fluoreszcens háttér, amely gyakran megfigyelhető a fluoreszceinnel és texas red-del erősen (direkt)jelölt antitesteknél. Ezek a konjugátumok "ragadósak" (a sok ligand miatt) így nem specifikusan kötődhetnek a szövetekben, amíg ez a jelenség a fluorokróm konjugált Avidin D-vel nem fordul elő.
• Az extrém nagy avidin/streptavidin és biotin affinitás miatt a konjugátum (komplex) gyorsan kialakul és stabil marad.
• Egyszerre több antigén kimutatása is lehetséges ugyanazon metszeten, két vagy három (ugyanolyan típusú) primer antitesttel. Akár különböző enzim vagy ugyanolyan enzim más szubsztráttal használható, illetve megfelelő fluorokrómok alkalmazása is lehetséges.

A biotin-avidin rendszer alkalmazási területei

A biotin-avidin rendszer számos esetben jobban használható, mint egyéb konvencionális, kevésbé érzékeny módszerek. Az alkalmazások közül néhány:

• Immunhisztokémiai festés
• Többszörös jelölés szöveteken
• Hormon kötőhelyek lokalizálása
• Áramlásos citometria
• Nitrocellulóz és nylon transzfer blot detektálás
• In situ hibridizáció
• Radio-, enzim- és fluoreszcens immunoassay
• Neuronális nyomkövetés
• Genetikai térképezés
• Hibridóma screen
• Sejfelszíni antigén tisztítás
• Antitestek és antigének kapcsolása agarózhoz
• Membrán vezikulumok irányultságának vizsgálata

Termékek

• Anti avidin reagensek
• Anti biotin antitestek
• Anti streptavidin reagensek
• Avidin reagensek
  • Avidin/biotin blokkoló kit
• Biotinilált reagensek
• Biotiniláló reagensek
  • QuantTag biotin kvantifikáló kit
• VECTASTAIN ABC rendszerek
• Vector Mouse on Mouse (M.O.M.™) kitek

További (angol nyelvű) információ....